PCR (Polymerase Chain Reaction- Polimeraz Zincir Reaksiyonu) testi bu günlerde corona virüs salgını nedeniyle sık sık gündeme gelen bir testtir. Corona virüs teşhisi için kullanılan bu testin başta sağlık alanı olmak üzere birçok kullanım alanı bulunur. Bu yazıda PCR testinin tam olarak ne olduğu, hangi amaçlarla kullanıldığı, PCR testinin uygulanma şekli ve uygulanırken dikkat edilmesi gerekenler, corona virüste nasıl kullanıldığı gibi başlıklar ayrıntılı olarak incelenmiştir.

PCR testi nedir? PCR testi esası nedir?

PCR (Polymerase Chain Reaction- Polimeraz Zincir Reaksiyonu) DNA içindeki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir. PCR yöntemi kısaca DNA replikasyonunun belirli sayıda sürekli taklit edilmesi ya da tekrar edilmesidir. Bu yöntem ayrıca “in vitro” yani cansız ortamdaki klonlama işlemi olarak da tanımlanabilir. PCR testi bir moleküler tanıma tekniğidir. PCR testi moleküler tanıma teknikleri arasında ilerlemiş ve duyarlılığı fazla olan bir tekniktir. Çok az sayıdaki mikrobu dahi ayırt edebidiği için ilerlemiş bir teknik olarak kabul edilebilir.

PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) tekniği DNA’nın iki zincirinin yüksek ısıya maruz bırakılarak ayrılmasına yani tek sarmal haline gelmesine, sonrasında sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA’ya bağlanarak zincirin uzamasına ve bu döngünün belirli bir sayıda tekrarlanmasına dayananır. Bu sayede bu teknik az sayıdaki mikropları bile çoğaltarak tanınabilir hale getirir.

PCR testi neden yapılır? PCR testinin kullanım alanları nelerdir?

PCR testi, temeli teşhis olan birçok araştırmada, çalışmada, bilinmeyen özelliklerin tayininde kullanılmaktadır. PCR testinin sağlık alanındaki kullanımlarına örnekler aşağıda verilmiştir.

1. Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı: PCR testinde gen dizilerinin çoğaltılması ile bu genlerdeki bozukluklar tespit edilebilmektedir. Taşıyıcılarda dahi erken teşhis konulabilmesi bu testin büyük bir avantajıdır.

2. Prenatal tanıda: Doğum öncesinde fetüsteki anormallikler bu yolla tespit edilebilmektedir. Bu anormallikler genellikle genetik hastalık kaynaklıdır.

3. Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması: Az sayıdaki mikrobu dahi çoğaltarak patojen organizmaların ayırt edilmesinde büyük katkısı vardır. Hastalık teşhisinde hızlı ve duyarlı bir tekniktir. Corona virüs tespitinde de patojen organizma bu yolla tanınabilmektedir ve teşhis konulmaktadır.

4. Adli tıpta: Bu yöntemde PCR testinde gerçekleştirilen gen dizileri çoğaltılması ile suçlu kişilere ait DNA analizi yapılabilmektedir. Bu nedenle adli tıpta büyük bir öneme sahiptir.

5. Kanser ile alakalı araştırmalarda: Tümör oluşan genlerdeki mutasyonlar PCR testi sayesinde tespit edilebilmektedir.

6. Babalık testinde,

7. Probe’ların oluşturulmasında/ klonlamada/ gen ekspresyon araştırmalarında,

8. DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında,

9. Bilinmeyen dizilerin tayininde,

10. Geçmiş DNA’nın incelenmesi ve evrimin aydınlanmasında,

11. Biyoteknoloji alanında aşıların geliştirilmesinde,

12. In vitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılması ve sonra implantasyon gerçekleştirilmesi ile bebeğin normal doğmasının sağlanması,

13. PCR kaynaklı RAPD, AFLP, SSR ve ISRR gibi birçok bitki ve hayvanda genetik akrabalığın teşhisinde kullanılan teknikler geliştirilmesinde,

14. DNA protein interaksiyonunun araştırılmasında (footprinting) kullanılabilir.

PCR testi yukarıda sayılan sağlık alanındaki kullanımları dışında gıda sektöründe de birçok kullanım alanına sahiptir.

Corona virüs teşhisinde PCR testi kullanımı

Corona virüs tanı testleri moleküler ve serolojik testler olarak iki tiptir. Corona virüs teşhisinde kullanılan testler virüsün genetik materyalini (DNA veya RNA olabilir) veya antijenik materyalininin virüse karşı oluşturduğu antikorların tespiti yardımıyla yapılabilmektedir. Virüsün genetik materyalini tespit etmeye yarayan testlere moleküler testler denilirken virüsün antijen- antikorunu tespit etmeye çalışan testlere serolojik testler denilmektedir. Antikor-antijen testleri yani serolojik testler daha önce geçirilmiş olan veya o anda geçirilmekte olan viral enfeksiyonun aşamalarını tespit edebilmek için kullanılan testlerdir. Corona virüste serolojik testlerin doğrulanması için ise gerçek zamanlı PCR testi kullanılabilmektedir. Kullanılacak olan testler hastalığın evresine göre seçilebilmektedir.

PCR testinin corona virüs teşhisinde kullandığı esas virüste RNA’ya bağlı olarak bulunabilen RNA polimeraz enzim genini yani genetik materyalini tespit etmesidir. Bu test mutlaka bilgili bir mikrobiyolog, laborant tarafından uygulanmalıdır. Aksi takdirde çok yanlış sonuçlara yol açabilmektedir. Yanlış sonuçlar neticesinde hastalığın teşhis edilememesi ve bu durum da virüsün daha fazla yayılmasına yol açabilmektedir.

Sonuçların negatif gelmesi durumunda testin yanlış uygulanmış olma olasılığının göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Testin doğru sonuç verebilmesi için örneğin alındığı zaman ve örneğin doğru alınıp alınmadığı da çok önemlidir. PCR testinin performansı RNA tespitinden teşhis yaptığı için alınan örnekte bulunan RNA bolluğuna göre değişmektedir. Bu yüzden alınan örneğin kalitesi de bu testin verimliliği için çok önemlidir. Ayrıca alınan örneğin uygun olmayan şekilde transferinin yapılması da sonuçlarda yanlışlık doğurabilmektedir. Virüs mutasyonu veya PCR test inhibisyonu gibi testi yapan kişiden kaynaklı olmayan teknik hatalar da testin uygulanması sırasında oluşabilecek hatalar arasındandır.

Bu zamanda PCR için iki tip uygulama bulunmaktadır. Bu tipler gerçek zamanlı sonuç veren ve hızlı sonuç veren PCR testleridir. Gerçek zamanlı PCR testinde sonuç alınması 3-4 saati bulurken hızlı sonuç veren PCR testlerinde bu süre 1,5 saate kadar inebilmektedir. Türkiye’de bu tiplerden gerçek zamanlı PCR testi kullanılmaktadır.

Corona virüs teşhisi için uygulanan PCR testinde hastadan nazofaringeal sürüntü (burun veya boğazdan sürüntü alınması) veya alt solunum yoluna ait balgam örneği gibi solunum yoluna ait bir organdan örnek alınması gerekmektedir. Bu örnek alınmasında farklı yöntemler kullanılabilmektedir. Bu yöntemler içinde olan boğaz çubuklarıyla örnek alınması ilk hafta için doğru sonuç verebilecek bir yöntemdir. Hastalığın devamında yani hasta pnömonili hale geldiğinde virüs akciğerlerde hızla yayılırken boğazda sayısı azalarak kaybolabilir ve bu nedenle boğazdan alınan örneğin teşhis için bir anlamı kalmayabilir. Bu yüzden hastalığın ilk haftasından sonra hastalık ilerlediği için öksürük materyali olan balgam üzerinden teşhis yapılabilmektedir.

Örnekler doğru zamanlarda ve doğru şekillerde alındıktan sonra, alınan örnekler virüs RNA’sının çözeltiye geçişini sağlayabilecek bir sıvı viral taşıma besiyerine konulur. Ardından, örnekten çözeltiye geçen RNA’lar bu çözeltiden ayrıştırılır ve sonrasında bu RNA teşhisin kolaylaşması için çoğaltılır. Çoğaltılan RNA üzerinden hangi virüs tipine ait RNA olduğu laboratuvarda yapılan bir takım testlerle belirlenir ve böylece teşhis konulur.

PCR; 94 °C-98 °C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon yani yüksek ısıya maruz kalan DNA’nın iki zincirinin ayrılması, 37 °C-65 °C aralığında gerçekleştirilen tavlama yani sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA’ya bağlanması (hibridizasyon) ve 72 °C’de gerçekleştirilen uzama aşamaları olmak üzere 3 aşamadan meydana gelir ve bu aşamaların belirli döngüde, belirli sayıda tekrarlanması ile gerçekleştirilir.

Direkt sonuç veren corona virüs testleri yanında PCR testinin dezavantajı daha geç sürede sonuç vermesidir fakat PCR yönteminin az sayıdaki patojenleri bile tespit etmesi bu yöntemin diğer yöntemlerden daha duyarlı olduğunu gösterir. Bu testin daha duyarlı olması da diğer testlere göre bu testin avantajları arasında sayılabilmektedir. PCR tekniği radyoaktivite ihtiyacını azalttığı için de çok avantajlı olan bir yöntemdir. Radyoaktif teşhis yöntemleri genel olarak vücuda olan zararlarıyla bilinmektedir bu özelliğinden dolayı teşhis yöntemleri arasında PCR tekniğinin daha ön plana çıkmasına, daha kullanılabilir olmasına yol açmıştır.

Doğru zamanda ve doğru yöntemlerle laboratuvar ortamında uygulanan corona virüs teşhis testleri salgını kontrol altına almada sürecin önemli bir parçasıdır. Bu nedenle belirtileri olduğunu düşünen hastalar mutlaka en yakın sağlık merkezine başvurmalıdır.

Kaynak Bilgisi : MedicalPark